菌种的比浊度与菌含量的关系及其应用
来源：https://www.shuizhifenxi.com/ 作者：余氯检测仪 时间：2018-12-27
摘 要：简介比浊法和活菌计数法测定菌液浓度的操作步骤和优缺点，将比浊法与活菌计数法相结合，测定了常见模式菌株比浊度对应的活菌计数浓度，为菌种浓度的预估提供一个快速，准确，便捷的方法。
关键词：菌液浓度;活菌计数;比浊度
在微生物检验工作中，比如药品微生物限度检查方法验证、防腐效力测试、消毒液消毒效果验证、培养基适用性检查等等，常常需要加入一定浓度的菌悬液，菌液浓度过高或过低都将影响测试结果的准确性，因此控制菌液浓度是必要且关键的一步。测定菌液浓度的方法一般有三种，其一为活菌计数法，此法能准确判断菌液浓度，是目前国内的仲裁法，但是该法需要培养后计数，有明显的滞后性;其二为显微镜观察法，该方法适用于菌体较大的菌种浓度的测定，如霉菌和酵母菌，具有方便快捷的优点，但不适用于菌体细小的菌种浓度的测定，有较大的局限性;三为比浊法，此法能快速地判断菌液浓度，但结果为粗略的估计值，不同大小的菌种其形成的光密度不同，因此同一个比浊度，不同的菌结果差异较大，准确性不高。
本文具体介绍将比浊法和活菌计数法相结合的测定方法，测定了常见模式菌株1麦氏比浊度(MCFARLAND)的菌液浓度，用于指导日常微生物检测工作中菌液浓度的快速、准确测定，具有较强的实用价值。
一、菌种及菌液的制备
1.菌种
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC 6538)
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027)
大肠埃希菌(Escherichia coli ATCC 8739)
枯草芽孢杆菌( Bacillus subtilisATCC 6633)
乙型副伤寒沙门氏菌(Salmonella paratyphiCMCC(B)50094)
白色念珠菌(Candida albicans ATCC 10231)
黑曲霉(Aspergillusniger ATCC 16404)
以上菌种从广东省微生物菌种保藏中心采购，经复苏两代至五代内使用。
2.菌液的制备
(1)将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、乙型副伤寒沙门氏菌的冻干管封口端(即远离冻干粉的一端)在火焰上分别灼烧后，迅速滴加几滴灭菌水，使灼烧处管口裂口后，在生物安全柜内用灭菌镊子轻轻掰开裂口，分别用0.5mL TSB溶解冻干菌种，然后将溶解后的冻干菌株全部转移到10mL TSB中，置36±1℃恒温培养箱中培养18～24小时，此为第一代菌种。在生物安全柜内分别用无菌接种环挑取1接种环第一代上述菌悬液分别划线接种于TSA中然后置于36±1℃恒温培养箱中培养18～24小时，此为第二代菌种，备用。
(2)将白色念珠菌冻干管封口端在火焰上灼烧后，迅速滴加几滴灭菌水，使灼烧处管口裂口后，在生物安全柜内用灭菌镊子轻轻掰开裂口，用0.5mL改良马丁液体培养基溶解冻干菌种，然后将溶解后的冻干菌株全部转移到10mL 改良马丁液体培养基中，置28±1℃恒温培养箱中培养24～48小时，此为第一代菌种。在生物安全柜内无菌接种环挑取1接种环第一代菌悬液划线接种于改良马丁琼脂培养基中。将新鲜接种的改良马丁琼脂培养基置28±1℃恒温培养箱中培养24～48小时，此为第二代菌种，备用。
(3)将黑曲霉冻干管封口端在火焰上灼烧后，迅速滴加几滴灭菌水，使灼烧处管口裂口后，在生物安全柜内用灭菌镊子轻轻掰开裂口，用0.5mL含0.05%吐温80的0.9%无菌氯化钠溶液溶解冻干菌种，然后将溶解后的冻干菌株划线接种到改良马丁琼脂斜面培养基中，置28±1℃恒温培养箱中培养5～7天，此为第一代菌种。在生物安全柜内，用无菌接种环挑取1接种环第一代黑曲霉划线接种于改良马丁琼脂斜面培养基中。然后置28±1℃恒温培养箱中培养5～7天，此为第二代菌种。向第二代黑曲霉菌种管内加入5ml含0.05%吐温80的0.9%无菌氯化钠溶液，用无菌接种环将孢子洗脱，吸出孢子悬液(用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管)至无菌试管内，备用。
二、培养基和仪器
1.培养基
(1)商品培养基。
胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)瓶装颗粒培养基
胰蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA)
改良马丁液体培养基
改良马丁琼脂培养基
0.5%无菌T.T.C
以上培养基从广东环凯微生物科技有限公司采购商品培养基，按产品说明书配制，灭菌后备用，其中TSA在使用前每100mL培养基加入1mL0.5%无菌T.T.C以便于细菌菌落的观察。
(2)按配方配制的培养基。
0.85%氯化钠
0.9%氯化钠
含0.05%吐温80的0.9%氯化钠
以上培养基按配方配制，灭菌后备用。
2.仪器
生物安全柜(型号：SBSC1600ⅡB2)
恒温培养箱(36±1℃，28±2℃)
麦氏比浊仪(产品货号：WGZ-XT，生产商：丰临)
漩涡混合器(型号：QA-1)
三、菌种比浊度的测定及调节
1.按仪器使用说明书操作，用标准麦氏比浊管检定仪器，当不同浓度的麦氏比浊管读数与标准麦氏比浊管标定的值在误差允许范围内时，方可进行下一步骤。
2.用0.85%无菌氯化钠作为空白，调零。
3.分别用无菌接种环挑取1.2.1和1.2.2的平板上菌落适量，分别在装有5mL 0.85%氯化钠的50mL锥形瓶瓶壁上将菌分散(蘸取少量氯化钠后在瓶壁上来回划线，以便将菌分散后使之易于混匀)，然后用混合器将菌液混匀备用。
4.测定菌液比浊度，用相应菌种的菌落或氯化钠调节菌液的浓度，使菌液比浊度读数约为1MCFARLAND。
四、活菌计数法计数各菌种1 MCFARLAND的菌含量
1.金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、乙型副伤寒沙门氏菌在生物安全柜内进行操作。用0.85%无菌氯化钠作为稀释剂，10倍梯度逐级稀释至10-7，分别依次测定每种菌10-5～10-7三个稀释倍数的菌落数。用移液枪及灭菌移液枪头各吸取1mL注入灭菌平皿中，每种菌每个梯度制备2个平行。注入约20mL，45℃～50℃的TSA培养基，随即转动平皿，使样品与培养基充分混合均匀，待培养基凝固后，翻转平皿，置36℃±1℃恒温培养箱内培养48h，然后进行菌落计数。先用肉眼观察，必要时可用放大镜，点计菌落数，记下各平皿的菌落数后，求出每种菌的平均菌落数，换算成每种菌1 MCFARLAND的菌含量。
2.白色念珠菌和黑曲霉在生物安全柜内进行操作，白色念珠菌用0.85%无菌氯化钠作为稀释剂，黑曲霉用0.9%无菌氯化钠作为稀释剂，10倍梯度逐级稀释至10-6，每种菌分别测定10-4～10-6三个稀释倍数的菌落数。用移液枪及灭菌移液枪头各吸取1mL注入灭菌平皿，每种菌每个梯度制备2个平行。注入约20mL，45℃～50℃的改良马丁琼脂培养基，随即转动平皿，使样品与培养基充分混合均匀，待培养基凝固后，翻转平皿，置28℃±1℃恒温培养箱内培养72h后，进行菌落计数。先用肉眼观察，必要时可用放大镜，点计菌落数，记下各平皿的菌落数后，求出每种菌的平均菌落数，换算成每种菌1 MCFARLAND的菌含量。
五、结果与讨论
每种菌独立重复三次实验，计算三次重复实验每种菌1MCFARLAND所含的平均菌落数。结果如下表：
由表1可以看到：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、乙型副伤寒沙门氏菌、白色念珠菌以及黑曲霉每1MCFARLAND采用活菌计数法计数所得的菌液含量具有良好的重现性，三次独立重复实验测定的菌液含量相对偏差小于50%。菌液的比浊度的菌液体的大小有有关，菌体越大，相同比浊度的菌液含量越少。
六、结论
通过本实验证实，菌液含量(CFU/mL)与菌液的比浊度(MCFARLAND)有良好的相关性，可将实验用菌悬液调节至1MCFARLAND，通过活菌计数法确定实验用菌悬液的含量，以便较准确的预估实验用菌株浓度及所需要稀释的级别。用平板制备的菌落，可采用适宜的稀释剂作为比浊仪的空白对照，调零。此方法特别适用于枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞杆菌等在液体培养基上易形成块状或絮状物等不易打散的菌液的计数。若采用液体培养基增菌的菌液则用相应的液体培养基作为比浊仪的空白对照，调零。
由于实验室间条件差异;培养基产地、批号不同;操作人员与系统误差等原因，同一菌种比浊度对应的菌液含量会有一定差异，建议在同一实验室一旦有因素变化，应再重新确定菌种比浊度对应的菌液含量。
参考文献：
[1]朱艳静，李宇.测定菌体浓度的简便方法[J].上海市工业微生物研究所，2002，第36卷第4期：47-49.
[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典[ M ].四部.北京：中国医药科技出版，2015： 1105.
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